Diagnostische Möglichkeiten

Für die prädiktive Tumoranalyse steht bereits ein ganzes Portfolio von Biomarkern zur Verfügung. Eine besonders interessante Markergruppe stellen dabei die Genfusionen dar. Hier kommt es durch chromosomale Umlagerungen (z. B. Inversionen, Translokationen, Deletionen) zur physischen Verknüpfung zuvor unabhängiger Genregionen. Wird dabei der starke Promotor eines Gens mit dem funktionellen Bereich eines Protoonkogens kombiniert, kann es zur unregulierten Aktivierung des Fusionsproteins kommen. Dieses stellt dann einen potenten Treiber für die maligne Transformation und die Entwicklung des Tumors dar. Inzwischen sind mehr als 10.000 onkogene, oft tumorspezifische Genfusionen bekannt. Besonders häufig sind Fusionen zwischen Genen für Tyrosinkinasen, DNA-Bindungs- und chromatinmodifizierenden Proteinen. Einige Genfusionen repräsentieren bereits etablierte diagnostische Werkzeuge. Dazu gehören ALK- und ROS1-Fusionen als prädiktive Marker für den Einsatz von Tyrosinkinase-Inhibitoren beim nicht kleinzelligen Lungenkarzinom (NSCLC) oder die diagnostische BCR-ABL-Fusion bei chronischer myeloischer Leukämie (CML). Mit der EU-Zulassung von Larotrectinib und der Testung weiterer Multikinase-Inhibitoren, die gegen neurotrophe Tropomyosin-Rezeptor-Kinasen (TRK) unabhängig von der Tumorentiät wirken, rücken nun die NTRK-Genfusionen in den aktuellen therapeutischen Fokus.

Tropomyosin-Rezeptor-Kinasen

Die Familie der Tropomyosin-Rezeptor-Kinasen (TRK) wird durch die drei eng verwandten Transmembran­proteine TRK A, TRK B und TRK C repräsentiert. Sie weisen eine charakteristische intrazelluläre Tyrosin­kinase-Domäne auf und werden durch Bindung spezifischer Neurotrophine aktiviert. TRK A bindet bevorzugt den Nervenwachstumsfaktor (NGF), während TRK B eine höhere Affinität für BDNF (brain-derived neurotrophic factor) und Neurotrophin-4/5 besitzt. TRK C wird durch Neurotrophin-3 aktiviert (Abb. 1). Nach der Ligandenbindung kommt es zur TRK-­Rezeptordimerisierung und zur Autophosphorylierung von Tyrosinresten in der Aktivierungsdomäne der Kinaseregion. Nach Andocken weiterer zytoplasmatischer Kofaktoren und Enzyme werden verschiedene biochemische Signalwege wie RAS-RAF-MAPK, PI3K-AKT-mTOR und PLC-γangeschaltet.

TRK-Rezeptoren spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung neuronaler Strukturen in der Embryogenese. Sie sind u. a. an der Differenzierung und Vermehrung neuronaler Zellen, der Axon- und Dendritenbildung sowie der Synapsenformation beteiligt. Im Erwachsenenalter befinden sich TRK-Rezeptoren vorwiegend in neuronalen Geweben und glatter Muskulatur. Dabei kontrollieren und vermitteln sie wichtige Funktionen zur Erhaltung des Nervensystems, des Gedächtnisses, Schmerzempfindens und zum Überleben neuronaler Zellen. Störungen der TRK-Funktion sind mit der Pathogenese verschiedener neurodegenerativer und Tumorerkrankungen verbunden.

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NTRK-Gene und Genfusionen

Die Rezeptorkinasen TRK A, B und C werden respektive von den drei Genen NTRK1 (1q21–q22), NTRK2 (9q22.1) und NTRK3 (15q25) kodiert. NTRK-Gene besitzen ausgedehnte Intronregionen sowie ­GC-reiche Strukturen und repetitive Sequenzbereiche, welche eine Herausforderung für die genetische Analytik darstellen.

Die Expression der NTRK-Gene in den Nervenzellen ist strikt reguliert. Eine onkogene Wirkung entsteht erst durch die konstitutive Expression in verschiedenen Geweben. Das erfolgt hauptsächlich über die Bildung funktioneller Genfusionen. Dabei wird das 3’-Ende des NTRK-Gens mit dem 5’-Ende eines Partnergens kombiniert. Das resultierende Fusionsgen besitzt die N-terminale Signalregion des Partners und die intakte NTRK-Tyrosinkinase-Domäne am C-Terminus. Die neue Promotorregion sorgt für eine ligandenunabhängige Expression des TRK-Hybridproteins und eine stete Aktivierung von Signalwegen, die das Tumorwachstum unterstützen. Inzwischen sind an die 100 unterschiedliche NTRK-Fusionsgene in mehr als 30 Tumorentitäten beschrieben. Beispiele für Fusionspartner sind u. a. der Transkriptionsfaktor ETV6 oder das Aktin-bindende Protein TPM3.

NTRK-Fusionen kommen nur selten als Treibermutationen in Tumoren vor. Ihre durchschnittliche Häufigkeit liegt bei etwa 0,2–0,3 %. Allerdings zeigt sich in einigen wenigen Erwachsenen- und pädiatrischen Tumoren eine sehr hohe Frequenz. Am häufigsten (75–100 %) treten NTRK-Genfusionen beim sekretorischen Speicheldrüsenkarzinom, dem sekretorischen Mammakarzinom und dem infantilen Fibrosarkom auf.

Auch bei GIST und dem papillären Schilddrüsenkarzinom kommen sie in nennenswerter Frequenz vor (5–25 %). Genfusionen können alle drei NTRK-Gene betreffen, dabei scheinen NTRK1- und NTRK3-Alterationen etwas zahlreicher zu sein. In Gliomen findet man aber auch einen substanziellen Anteil von NTRK2-Varianten. Einige Fusionen sind pathognomonisch für bestimmte Tumorentitäten. So findet sich die ETV6-NTRK3-Variante in > 90 % der sekretorischen Mammakarzinome, MASC oder infantilen Fibrosarkome. Obwohl zahlreiche funktionelle NTRK-Genfusionen nachgewiesen wurden, existieren auch Nachweise von Fusionen ohne aktivierenden Charakter. Hier handelt es sich wahrscheinlich um sehr seltene Passenger-Mutationen in vorwiegend chromosomal instabilen Tumoren.

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Methoden der NTRK-Genfusionsdiagnostik Immunhistochemie

Die Immunhistochemie (IHC) erlaubt den Nachweis der TRK-Proteine mittels entsprechender Antikörper. Im Gegensatz zu allen anderen Techniken wird das Therapie-Target direkt in der Zelle detektiert. Eine IHC-positive Zelle, die normalerweise kein TRK exprimiert, kann also als Surrogatmarker für ein NTRK-Fusionsereignis gelten. IHC-Analysen gehören zur diagnostischen Routine in der Pathologie. Sie sind relativ kostengünstig und materialschonend. Das Ergebnis liegt innerhalb von ein bis zwei Tagen vor.

Für die NTRK-Expressionstests wird gegenwärtig der rekombinante anti-pan-TRK-Antikörper-Klon EPR17341 verwendet (Abb. 2a). EPR17341 bindet an die C-terminale Proteinregion und erlaubt den simultanen Nachweis von TRK A, TRK B und TRKC. Der Kaninchen-Antikörper ist entweder separat (z. B. Abcam, Zytomed) oder als CE-IVD-zertifizierter Assay (Roche) verfügbar. Daneben sind noch weitere anti-pan-TRK-Antikörper wie RP176 (Diagnostic BioSystems) erhältlich bzw. in der Erprobung. Antikörper für den separaten Nachweis der einzelnen TRK-Proteine finden in der Routinediagnostik kaum Anwendung.

Als NTRK-positiv gelten Tumoren, wenn mindestens 1 % der Tumorzellen eine vom Hintergrund differenzierbare Anfärbung zeigen. Die Färbung kann verschiedene Zellkompartimente betreffen. Tumorzellen mit NTRK1/2-Fusionen weisen meist eine pan-TRK-Färbung im Bereich des Zytoplasmas auf, aber auch Kernmembranfärbungen kommen vor. Die Färbeintensität ist dabei moderat bis stark. Tumorzellen mit NTRK3-Fusionen zeigen sowohl zytoplasmatische als auch nukleäre Farbreaktionen. Zudem fällt die Färbung bei Vorliegen einer NTRK3-Fusion etwas schwächer aus. Insgesamt wird die Lokalisation der Expression wesentlich vom Fusionspartner mitbestimmt. So zeigen LMNA-NTRK1-Fusionen eine perinukleäre Färbung, da das LMNA-Gen für Strukturkomponenten der Kernmembran kodiert.

Trotz der Seltenheit von NTRK-Fusionen bei vielen Tumoren sind bereits zahlreiche Publikationen zur Testeffizienz der pan-TRK-IHC erschienen, aus denen sämtliche quantitativen Daten stammen. Sowohl die durchschnittliche Sensitivität (~ 88 %) als auch die Spezifität (92–100 %) der IHC sind hoch. Es existieren aber deutliche Schwankungen zwischen Genen und Tumorentitäten. Die höchsten Detektionsraten werden mit 96–100 % bei NTRK1 und NTRK2 erreicht. NTRK3-Fusionen haben eine erheblich niedrigere Sensitivität von ~ 79 %. In Bezug auf die Tumorentitäten wird die Sensitivität bei Kolon- und Lungenkarzinomen mit ~ 88 % und beim Melanom sogar mit 100 % angegeben. Die Spezifität liegt hier bei 100 %. Tests bei Mammakarzinomen und Sarkomen weisen eine deutlich geringere Sensitivität von nur 80 % auf. Diese Tumoren haben die höchste Rate falsch negativer Testergebnisse, wahrscheinlich aufgrund häufiger NTRK3-Fusionen. Die geringste IHC-Spezifität wurde bei Gliomen (21 %) und ­Speicheldrüsentumoren (52 %) gefunden. Bei Tumoren mit neuraler, neuroendokriner oder glattmuskulärer Differenzierung, die eine natürliche NTRK-Expression zeigen, ist die pan-TRK-IHC als Screeningmethode wenig geeignet. Sie stellt aber eine effiziente Prüfmethode für die Translation unbekannter NTRK-Translokationen dar.

Fluoreszenz-in-Situ-Hybridisierung

Mit der Fluoreszenz-in-Situ-Hybridisierung (FISH) können definierte DNA-Abschnitte innerhalb der Zelle durch Bindung an eine komplementäre, fluoreszenzmarkierte Nukleinsäuresonde detektiert werden. Die FISH ist eine in der Molekularpathologie verbreitete Routinemethode, z. B. für den Nachweis prädiktiver ALK-, ROS1- und RET-Fusionen beim NSCLC. Die Bearbeitungszeit beträgt zwei bis vier Tage.

Bei der NTRK-FISH werden aufgrund der zahlreichen Fusionspartner meist Break-Apart-Sonden eingesetzt. Bei dieser Technik flankieren zwei farblich ungleich markierte Sonden die Bruchpunkt-Region im zu untersuchenden NTRK-Gen. Aufgrund ihrer räumlichen Nähe zeigen Chromosomen ohne Translokation ein Mischsignal oder eng beieinanderliegende Farbsignale (meist rot und grün). Tritt eine Translokation auf, z. B. bei einer NTRK-Genfusion, dann werden die Farbsignale deutlich separiert (split signals oder break apart signals) (Abb. 2b). Für die NTRK-FISH sind verschiedene Sonden kommerziell erhältlich. Es gibt Sonden für den spezifischen Nachweis von ETV6-NTRK3-Fusionen. Meist werden aber drei parallele Hybridisierungen mit separaten Sonden für NTRK1–3 durchgeführt. Damit ist die FISH für ein Routinescreening diverser Tumorentitäten recht aufwendig, zumal die Auswertung der Fluoreszenzmuster einiges an Erfahrung und Zeit erfordert. Der Grenzwert für einen positiven NTRK-Translokationsnachweis liegt je nach Sonde bei etwa 5–15 % Tumorzellen mit aberranten Signalen. Ein Nachteil der NTRK-FISH-Analytik besteht darin, dass die Funktionalität der genetischen Veränderung nicht beurteilt werden kann. Die Unterscheidung zwischen Translokationen, die das Leseraster für die Proteinsynthese erhalten, und solchen, die es zerstören, ist nicht möglich. Auch bleibt der 5‘-Fusionspartner meist unbekannt. Problematisch gestaltet sich auch die Beurteilung abweichender Signalmuster. So finden sich neben den klassischen Break-apart-Signalen auch Tumoren mit vorherrschend grünen oder roten Einzelsignalmustern (Abb. 2c). Hier führen verschiedene intragenetische Veränderungen (Inversionen, Deletionen) oder größere Translokationen zum Verlust der Bindungsfähigkeit der entsprechenden zweiten Sonde. Trotzdem bleibt die FISH-Analytik eine sensitive und effektive Methode, insbesondere bei Tumoren mit hoher NTRK-Prävalenz (z. B. EVH6-NTRK3). Bei Tumoren mit geringer NTRK-Prävalenz sollte das FISH-Ergebnis mit einer zweiten Methode verifiziert werden (IHC, NGS).

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Reverse-Transkriptase-Polymerase-­Kettenreaktion (RT-PCR)

Die RT-PCR kann komplementär oder alternativ zur FISH-Analytik durchgeführt werden. Sie stellt eine Zwei-Stufen-Technik dar. Zuerst wird die RNA in cDNA umgeschrieben und danach erfolgt die eigentliche Amplifikation der NTRK-Fusion. Der PCR-Nachweis erfolgt mit Primern, die sowohl im 5‘-Fusionspartner als auch in der NTRK-Kinase-Domäne binden. RT-PCR erlaubt die Detektion sowohl bekannter als auch unbekannter Transkripte. Neue Fusionspartner können dagegen nicht nachgewiesen werden. Als problematisch für das Design einer repräsentativen Multiplex-PCR erweist sich die hohe Anzahl von NTRK-Translokationspartnern sowie die Diversität der Bruchpunkte. Einige RT-PCR-Kits fokussieren sich daher auf einzelne (z. B. ETV6-NTRK3) oder mehrere häufige NTRK-Fusionen. Es sind aber bereits RT-PCR-Kits erhältlich, die mehr als 100 Fusionsvarianten für NTRK1/2/3 detektieren. Im Vergleich mit anderen molekularen Nachweismethoden bietet die RT-PCR eine sehr hohe Spezifität und Sensitivität. Weitere Vorteile sind eine kurze Bearbeitungszeit und relativ niedrige Laborkosten. Einen limitierenden Faktor stellt die Qualität der RNA dar. Insbesondere bei Formalin-fixierten paraffineingebetteten Gewebeproben ist diese nicht selten stark degradiert und eine Qualitätskontrolle der RNA vor Testung ist notwendig, um falsch negative Resultate zu vermeiden.

DNA und RNA Next Generation Sequencing (NGS)

DNA-NGS erlaubt die simultane Detektion verschiedener genetischer Alterationen in der genomischen DNA des Tumors. Dabei konzentrieren sich bestimmte Assays auf definierte Genregionen (Target-NGS) oder analysieren das ganze Genom (Whole Genome Sequencing, WGS). Aufgrund des hohen Aufwandes und der substanziellen Kosten wird das WGS in der onkologischen Routinetestung aber nicht durchgeführt.

Beim Target-NGS kommen meist Amplikon- (Sequen­zierung kurzer PCR-Fragmente) und Sondentechni­ken (hybrid capture) zum Einsatz. Beide Metho­den haben ihre Vor- und Nachteile, wobei letztere eine größere Uniformität bei der Sequenziereffizienz unterschiedlicher Zielgene zeigt. Es existieren eine Reihe kommerzieller und laboreigener Target-NGS-Panels, welche die Analyse von NTRK-Fusionen gestatten. Die Sensitivität eines solchen Panels wird von der Anzahl der Bruchpunkte bestimmt, die durch die jeweiligen Amplikons oder Sonden abgedeckt werden. Aus diesem Grund lassen sich mit den meisten Assays NTRK1-Fusionen recht umfassend analysieren. NTRK2- und NTRK3-Fusionen werden dagegen deutlich schlechter detektiert, da deren große intronische Bereiche und repetitive Regionen das Sondendesign erschweren. Viele kommerzielle Genpanels fokussieren daher auf häufige Fusionsvarianten dieser Gene. So liegt die Sensitivität für NTRK3-Fusionen bei ausgewählten DNA-Panels bei etwa 77 %. Da nicht alle strukturellen NTRK-Varianten hinsichtlich ihrer Funktionalität mit DNA-NGS beurteilt werden können, sollten zweifelhafte Ergebnisse mit einer alternativen Methode wie RT-PCR oder IHC überprüft werden. Ein großer Vorteil des DNA-NGS ist die Möglichkeit, auch andere Punktmutationen (SNV), kleinere Deletionen/Insertionen und Genamplifikationen nachzuweisen. DNA-NGS-Genpanels sind sehr robust und liefern selbst bei geringen DNA-Mengen gute Ergebnisse. Die Bearbeitungszeit beträgt in der Regel fünf bis zehn Tage.

RNA-NGS detektiert NTRK-Genfusionen direkt über das cDNA-Produkt der transkribierten RNA (mRNA). Genstruktur und Komplexität der Translokationen spielen für diese Methode kaum eine Rolle. Aus diesem Grund haben RNA-NGS-Panels eine bessere Detektionsrate für NTRK-Fusionsgene als das DNA-NGS. Gleichzeitig können die Fusionspartner leichter identifiziert und die Transkriptionen der vorliegenden NTRK-Translokationen bestätigt werden. Inzwischen liegen sehr gute Vergleichsdaten zum Einsatz unterschiedlicher kommerzieller RNA-NGS-Panels für die NTRK-Testung vor. Einen limitierenden Faktor für das RNA-NGS stellt die RNA-Qualität dar. RNA ist weniger stabil als DNA und das kann gelegentlich zum Analyseausfall führen. Auch die Unter- oder Überrepräsentation bestimmter mRNA in der cDNA-Bibliothek kann ein Problem darstellen. Vorgeschaltete Kontrollen zur Evaluierung der RNA-Qualität sind daher unerlässlich. Die Bearbeitungszeit von RNA-NGS-Panels liegt mit ein bis drei Wochen etwas höher als beim DNA-NGS. Mit RNA-NGS können andere Genalterationen, wie SNV, nur unzureichend detektiert werden. Zum Screening auf weitere therapierelevante Mutationen müssen daher zusätzliche Analysen durchgeführt werden, was den zeitlichen und finanziellen Aufwand deutlich erhöht. Eine Alternative könnten in Zukunft Hybrid-DNA/RNA-Panels bieten.

Andere NTRK-Alterationen & simultane Treiber

Neben Fusionsgenen treten noch weitere NTRK-Genalterationen auf. Die seltenen Punktmutationen sind meist nicht mit einer Überexpression der NTRK-Gene assoziiert. Einige Varianten (z. B. NTRK1-p.G595R, NTRK3-p.G263R) stellen aber einen Resistenzmechanismus für NTRK-Inhibitoren der ersten Generation dar. In der aktuellen EU-Zulassung von Larotrectinib ist die prädiktive Testung auf Resistenzmutationen aber nicht erforderlich (im Gegensatz zur FDA-Zulassung in den USA). NTRK-Genamplifikationen werden ebenfalls in Tumoren nachgewiesen (2–5 %). Auch ihre primäre Therapierelevanz ist bisher nicht ausreichend belegt. Bei NTRK-Fusionstumoren ist eine Reihe von Begleitmutationen in anderen tumorassoziierten Genen beschrieben, darunter ATM, BRAF, KIT, KRAS, PIK3CA, PDGFRA und TP53. Allerdings wiesen zumindest einige dieser ­Tumoren auch nicht funktionelle NTRK-Fusionen auf. In wenigen Fällen konnte gezeigt werden, dass weitere Treibermutationen im MAPK-Signalweg die Wirkung von Larotrectinib negativ beeinflussten.

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